一．基本信息
课程编号:
课程名称：细胞生物学实验
英文名称：Experiment of Cell Biology
课程性质:专业必修课
总 学 时：36
学 分：1
适用对象:生物科学专业
先修课程：植物学实验、动物学实验
二．编写说明
（一）课程的性质
细胞生物学实验是生物科学专业的必修课，是在掌握细胞生物学课程理论知识的基础上，理论与实践相结合，通过细胞生物学实验技能培训，进一步学习、研究细胞的结构与功能和生命活动规律的一门学科。
（二）课程教学目标基本要求
细胞生物学实验是细胞生物学课程教学的重要组成部分，是细胞生物学理论联系实际的重要课程之一。本实验课的目的在于加深学生对细胞生物学理论和实验基本原理的理解，培养学生研究型学习的能力，并为后续专业课的学习打好基础。通过对本课程的学习，要求对细胞生物学实验总体上应达到以下要求：
客观地对实验结果进行观察、比较、分析和综合的能力以及独立思考、解决实际问题的能力。通过实验课培养学生的实验技能，使学生能够正确使用细胞生物学实验的基本仪器设备，初步掌握细胞生物学实验的技术原理和基本操作技术。
（三）课程的重点和难点
本课程重点和难点内容包括：荧光显微镜的使用、细胞大小的测定、细胞凝集、细胞器的提取与纯化、细胞融合、细胞凋亡诱导及动物细胞的原代培养。
（四）课程教学方法与手段
学生预习实验内容、教师讲授、学生实际操作、教师指导、课堂讨论等形式。
（五）教学时数分配表
| 序号 |
实验项目名称 |
实验 要求 |
实验时数 |
实验 类型 |
| 1 |
普通光学显微镜和特殊显微镜的使用 |
必做 |
3 |
验证型 |
| 2 |
细胞形态观察和大小测量 |
必做 |
3 |
验证型 |
| 3 |
福尔根染色技术的应用 |
必做 |
3 |
验证型 |
| 4 |
血细胞凝集实验 |
必做 |
3 |
验证型 |
| 5 |
叶绿体的分离、纯化和鉴定 |
必做 |
3 |
验证型 |
| 6 |
线粒体的超速离心法分离 |
选做 |
3 |
验证型 |
| 7 |
动物细胞的原代培养 |
必做 |
3 |
综合型 |
| 8 |
细胞质膜的通透性观察 |
选做 |
3 |
验证型 |
| 9 |
小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力测定 |
必做 |
3 |
设计型 |
| 10 |
液泡系的超活染色和活死细胞鉴定 |
必做 |
3 |
验证型 |
| 11 |
小鼠M期染色体的制备与观察 |
选做 |
3 |
设计型 |
| 12 |
血细胞的分化与不同类型血细胞的观察 |
必做 |
3 |
验证型 |
| 13 |
植物细胞的脱分化与再分化 |
选做 |
3 |
综合型 |
| 14 |
植物细胞程序性死亡的诱导与鉴定 |
必做 |
3 |
研究型 |
（六）本课程与其它课程的联系
学习本课程之前，应先掌握动物学、植物学、生物化学等基础课程的理论知识和实验技能，为学生后继课程的学习和今后从事中学生物学实验教学工作打下扎实的基础。
（七）教材与主要参考书
1. 教材
《细胞生物学实验指南》丁明孝主编，高等教育出版社，2013。
2. 主要参考书
《细胞生物学实验技术教程》印莉萍主编，科学出版社，2015。
《细胞生物学实验教程》韩榕主编，科学出版社，2015。
（八）考核方式
本门课程为考查课程，根据学生上实验课的态度和出勤率，实验操作和实验报告写作和考试成绩对学生进行综合考核和评分。考试成绩占40%，实验报告占40%，考勤和平时成绩占20%。
三．教学内容纲要
实验一 普通光学显微镜和特殊显微镜的使用
实验目的：
熟悉普通光学显微镜的基本构造、性能和使用方法，了解特殊显微镜（相差显微镜和荧光显微镜）的工作原理、构造和使用方法。
实验内容：
普通光学显微镜主要由机械部分、照明部分和光学部分三部分构成，机械部分支撑显微镜结构以及放大倍数的调节，照明部分提供光源，光学部分用于观察目标的放大。孔径光阑和聚光镜位置调节后，开始观察样本。样本观察步骤：调节光照、调节目镜间距、低倍镜观察、高倍镜观察、油镜观察及油镜的维护。相差显微镜首先需熟悉相差原理，再通过调试观察目标。荧光显微镜是一种以荧光为介导的化学检测工具，首先需熟悉荧光显微镜的工作原理以及其与普通光镜的区别，再通过材料的准备、激发光的选择的等步骤观察目标。本实验中，绿色植物叶片表皮细胞叶绿体在蓝色激发光下，发出红色荧光。
主要仪器设备：
普通光学显微镜、相差显微镜、荧光显微镜
实验二 细胞形态观察和大小测量
实验目的：
了解常见动植物细胞的形态结构特点与差异，学习并掌握细胞大小的一般测量方法。
实验内容：
以多种植物和动物的组织切片为实验材料，用普通光学显微镜观察不同种类动植物细胞的形态、结构、大小、分布以及细胞器，分析他们的特点，并总结动植物细胞的形态结构差异。学习并掌握测微尺的使用方法和细胞大小的计算方法，用测微尺测量不同细胞的大小（直径）并作记录。学习细胞制图方法并绘制镜下观察的动植物细胞图，并标注细胞大小。
主要仪器设备：
光学显微镜、测微尺
实验三 福尔根染色技术的应用
实验目的：
以福尔根染色法为例学习细胞化学方法检测细胞核DNA的原理和方法，观察DNA在细胞内的形态和分布。
实验内容：
以新鲜洋葱鳞茎为实验材料进行福尔根染色实验。撕取小块洋葱内表皮，放入10mL预热60℃的1MHCl中温浴水解8~10min；自来水漂洗表皮5min；Schiff试剂避光浸染30min；用新鲜配置的亚硫酸水10mL漂洗2次，每次1min；用自来水漂洗5min；将表皮平铺于载玻片上，加盖玻片，在显微镜下观察。绘制洋葱内表皮细胞染色效果图，总结福尔根染色中应注意的问题。
主要仪器设备：
光学显微镜、恒温水浴锅
实验四 血细胞凝集实验
实验目的：
学习并掌握凝集素促使细胞凝集的基本原理，观察血细胞凝集现象。
实验内容：
凝集素是一类含糖的并能与糖结合的蛋白质。本实验选择土豆浸出液中的土豆凝集素和鸡血红细胞为实验材料，制备红细胞凝集模型并观察。取2g土豆块茎浸入10mL生理盐水中，持续2h；选取洁净的载玻片滴一滴土豆浸出液；加滴一滴2%鸡血红细胞悬液，并混匀；静置20min，低倍镜观察血球凝集，以生理盐水替代土豆浸出液加2%鸡血红细胞作对照。观察、比较两组结果的不同，绘图将观察结果记录下来。
主要仪器设备：
普通光学显微镜、移液器、双凹载玻片
实验五 叶绿体的分离、纯化和鉴定
实验目的：
掌握细胞组分的密度梯度离心分离技术；观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，熟悉荧光显微镜的使用。
实验内容：
选取菠菜叶片为实验材料提取叶绿体。洗净、干燥菠菜叶，并称取2~3g剪碎；加入预冷到0℃的匀浆介质10mL，研钵研磨；双层纱布过滤至烧杯；取滤液2mL500r/min离心10min，轻轻取上清液；在1.5mL离心管中依次加入500g/L蔗糖溶液和150g/L蔗糖溶液各0.4mL；小心地沿离心管加入0.4mL上清液；用水平转头离心8000r/min，20min；取出离心管，可见叶绿体在密度梯度溶液中间形成带；吸取叶绿体悬液分别用普通光镜和荧光显微镜观察。分析分离得到的叶绿体是否纯净，总结实验中应该注意的问题。
主要仪器设备：
普通光学显微镜、荧光显微镜、普通离心机和台式冷冻高速离心机
实验六 线粒体的超速离心法分离
实验目的：
了解细胞组分的差速离心分离技术的原理与应用，掌握小鼠肝细胞线粒体的分离与鉴定方法。
实验内容：
以小鼠为实验材料，提取小鼠肝细胞中的线粒体。实验前小鼠空腹12h，处死后取出肝脏生理盐水清洗，称取1~2g肝组织，加9mL匀浆介质在玻璃匀浆器中匀浆，悬液用纱布过滤；匀浆悬液1300离心10min，以沉淀未破碎的细胞、细胞核、结缔组织等；吸取上清液，冰浴上保存；重新悬浮沉淀再次离心；收集上清液于17000g离心15min以沉淀线粒体；弃上清，匀浆介质重新悬浮再离心，沉淀即为纯化线粒体；制备线粒体涂片，未干之前滴加10g/L詹纳斯绿B染液，染色20min，用水冲洗3次；加盖玻片在镜下观察，线粒体呈蓝绿色。
主要仪器设备：
光学显微镜、普通离心机、高速冷冻离心机、玻璃匀浆器
实验七 动物细胞的原代培养
实验目的：
熟悉并掌握动物细胞原代培养中的无菌操作技术；了解动物细胞原代培养的原理和方法。
实验内容：
以小鼠肝脏为实验材料学习动物体细胞的离体培养。处死小鼠，无菌获取小鼠肝脏，用无菌生理盐水清洗；将组织块剪碎，加入试管，再加入2~5倍体积0.25%胰酶（预热37℃）消化30min；取消化液1~2滴，镜检；消化液加完全培养基终止消化，再过滤离心1000r/min，5min；去上清，加入配好的DMEM培养基，控制细胞密度5×105~1×106，放入37℃培养箱中培养，隔天换液、观察。以上实验均在无菌环境中操作，所用器材均需消毒灭菌，杜绝污染。
主要仪器设备：
光学显微镜、普通离心机、细胞培养箱、超净工作台
实验八 细胞质膜的通透性观察
实验目的：
了解细胞膜特性以及细胞膜对物质通透性的一般规律。
实验内容：
以鸡血红细胞为实验材料检测细胞质膜的通透性特点。制备10%鸡血红细胞悬液；先后取试管一只，分别加入10 ml 150 mmol/L NaCl、蒸馏水、5 mmol/L NaCl、65 mmol/L NaCl、0.8 mol/L甲醇、0.8 mol/L乙醇和0.8 mol/L丙三醇，然后再加入1 ml 稀释的血液，注意观察溶液颜色的变化并记录下这个过程所要的时间；滴一滴稀释的血液于载玻片上，盖上盖玻片，用光学显微镜观察细胞的种类、形状和颜色；在上一步的载玻片的一端滴加清水，在另一端吸水，并在显微镜下观察细胞的破裂。
主要仪器设备：
光学显微镜、玻璃试管、移液器
实验九 小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力测定
实验目的：
通过小鼠腹腔巨噬细胞对异物吞噬现象的观察，了解巨噬细胞在非特异性免疫中的功能，掌握小鼠等实验动物腹腔巨噬细胞采集和制片的方法。
实验内容：
以小鼠为实验材料检测腹腔巨噬细胞的吞噬能力。实验前4~6天每日向小鼠腹腔注射1mL60g/L淀粉肉汤（含有台盼蓝）；实验前20~30min，向小鼠腹腔注射1mL1%鸡血红细胞悬液；处死小鼠，剪开腹腔，吸取适量生理盐水冲洗腹腔；将内脏推向一侧，吸取腹腔液，滴在载玻片上，盖上盖玻片，制成临时装片；将普通光学显微镜视野适当调暗后，对临时装片进行观察并统计红细胞的吞噬率。本实验，可以通过前期对小鼠进行饲养处理调节小鼠机体免疫状态，设计实验分析外源因素对小鼠免疫机能的影响。
主要仪器设备：
光学显微镜、解剖盘、注射器
实验十 液泡系的超活染色和活死细胞鉴定
实验目的：
掌握植物细胞液泡系超活染色方法，观察植物细胞液泡的形态、数量和分布特点，了解并掌握活死细胞的鉴定方法。
实验内容：
用洋葱鳞茎和口腔黏膜上皮细胞做实验材料进行实验。液泡系超活染色：用双面刀片把新鲜洋葱根尖（1~2cm长）小心切一纵切面（或直接用洋葱内表皮），放入载玻片中的1/3000中性红染液滴中，染色5~10分钟；吸去染液，滴一滴Ringer液，盖上盖玻片，并用镊子轻轻地下压盖玻片，使根尖压扁，利于观察。进行镜检。活死细胞鉴定：用0.2%的台盼蓝染液一滴，滴加在载玻片的中央；取洁净的牙签稍用力刮取口腔粘膜上皮细胞，均匀涂抹于台盼蓝染液中；染色5~10分钟后进行观察；切取面积约（0.5×0.5）cm2的洋葱内表皮，小心地平铺在载玻片的中央；向载玻片中央的洋葱内表皮上滴加1滴台盼蓝染液；染色5~10分钟后进行观察。
主要仪器设备：
普通光学显微镜、剪刀、镊子、载玻片
实验十一 小鼠M期染色体的制备与观察
实验目的：
掌握小鼠骨髓细胞染色体标本的制备方法，观察动物染色体的形态、结构和数目特征。
实验内容：
以小鼠为实验材料制备M期染色体标本并进行观察。小鼠处死前4h注射秋水仙素，剂量为每克体重2~4微克；取股骨和胫骨，并用6mL生理盐水冲洗，取骨髓细胞；低渗处理，取骨髓细胞悬液1000r/min离心10min，去上清并加75MKCl6~8mL，37℃水浴箱中低渗25min；预固定，加1mL固定液混匀，1000r/min离心10min；固定，去上清，滴加6~8mL固定液；制备细胞悬液，去上清，加入0.3~0.5mL固定液重悬；制片，吸取上述悬液滴加于载玻片上，使其干燥；吉姆萨染色10~15min，自来水冲洗，空气干燥；镜下观察染色体。
主要仪器设备：
光学显微镜、恒温水浴锅，普通离心机
实验十二 血细胞的分化与不同类型血细胞的观察
实验目的：
掌握微量采血及血涂片制作的方法，观察和识别血液中的红细胞、各类白细胞以及淋巴细胞，了解血细胞分化的基本知识。
实验内容：
以小鼠为实验材料，取血制备血涂片，观察血细胞。小鼠眼内取血100μL,加入装有10μL肝素溶液的离心管中轻轻摇匀，防止血液凝固；取10μL全血用于制作血涂片，作瑞氏染色和细胞形态观察。血涂片制备过程中，注意推片过程：取一块边缘光滑的载片做推片；将其一端置于血滴前方，向后移动到接触血滴，使血液均匀分散在推片与载片的接触处；然后使推片与载片呈30°～40°角，向另一端平稳地推出。涂片推好后，迅速在空气中摇，使之自然干燥。
主要仪器设备：
光学显微镜、微量毛细吸管，血推片
实验十三 植物细胞的脱分化与再分化
实验目的：
通过培养基配制、外植体杀菌、无菌接种等训练学习并掌握植物组织培养的基本技术，通过植物组织培养过程中细胞的分裂、增殖和分化验证植物的全能性。
实验内容：
以迎春花枝条为外植体材料进行培养实验。取迎春花枝条去叶、水洗、剪成5cm茎段；外植体消毒，无菌水反复冲洗；剪成1cm茎段；脱分化培养基培养3~4d；选取无染菌茎段脱分化培养基暗培养7d，得到愈伤组织；细胞分化培养基光照培养2~3周，得到迎春花再生苗。培养基配制中应注意PH，无菌操作在超净工作台中进行。本实验可以通过设计培养基成分配比，观察分化结果，分析影响植物组织分化的原因。
主要仪器设备：
光学显微镜、人工气候箱、超净工作台
实验十四 植物细胞程序性死亡的诱导与鉴定
实验目的：
了解植物细胞程序性死亡的概念及其与动物细胞程序性死亡的区别，掌握植物细胞程序性死亡的诱导和观察的基本方法。
实验内容：
以洋葱内表皮细胞为实验材料学习植物细胞诱导凋亡的方法和凋亡细胞鉴定技术。撕取适当大小洋葱内表皮，分别浸泡于0.5M氯化钙溶液（实验组）和PBS溶液（对照组）中，持续15min；用改良苯酚品红染色液，分别对实验组和对照组3种样品染色30min；洗去表面染料，放在载玻片上并压片；显微镜下观察细胞形态并拍照记录；对实验组和对照组细胞进行凋亡数目统计，并根据统计结果计算凋亡率。本实验可通过选择不同的诱导试剂或不同诱导浓度进行设计，并根据结果进行讨论。
主要仪器设备：
普通光学显微镜、镊子、平皿
大纲撰写人：陈宝玉
大纲审核人：
