一．基本信息
课程编号:1042008
课程名称：分子生物学实验
英文名称：Molecular biologyexpriments
课程性质:专业必修课
总 学 时：18
学 分：
适用对象:生物学及相关学科
先修课程：植物学动物学、微生物学、生物化学
二．编写说明
（一）课程的性质
《分子生物学实验》是生物科学专业的必修课，是在分子水平上阐明生物现象本质的科学实践课程。
（二）课程教学目标基本要求
分子生物学技术作为现代生物技术中最为先进的实验手段之一，现已渗透到生命科学、医学及农业、生产等各个领域，是一种非常重要的现代技术手段。通过《分子生物学实验》课程使学生了解分子生物学技术发展的现状、未来及应用，使学生掌握分子生物学技术的基本原理及有关的实验操作技术，提高学生的动手能力，为专业课程的学习及参加科研实践打下基础。
要求学生客观地对实验结果进行观察、比较、分析，培养学生综合分析的能力以及独立思考、解决实际问题的能力。通过实验课培养学生的实验技能，使学生了解分子生物学实验的基本仪器设备，能够初步掌握分子生物学实验的基本操作技术。
（三）课程的重点和难点
本课程重点和难点内容包括：核酸的性质、PCR原理、限制性核酸内切酶、核酸电泳、启动子的表达调节等。
（四）课程教学方法与手段
学生预习实验内容、教师讲授、学生实际操作、教师指导、课堂讨论等形式。
（五）教学时数分配表
| 序号 |
实验项目名称 |
实验 要求 |
实验时数 |
实验 类型 |
| 1 |
植物基因组DNA的制备 |
必做 |
3 |
验证型 |
| 2 |
核酸DNA的琼脂糖电泳 |
选做 |
3 |
验证型 |
| 3 |
大肠杆菌质粒DNA的制备 |
必做 |
3 |
验证型 |
| 4 |
双链DNA的酶切及检测 |
必做 |
3 |
验证型 |
| 5 |
目的基因的扩增 |
必做 |
3 |
验证型 |
| 6 |
大肠杆菌感受态细胞的制备 |
选做 |
3 |
验证型 |
| 7 |
食物中常见致病菌的检测 |
选做 |
3 |
综合型 |
| 8 |
真核生物启动子顺式作用元件的分析 |
必做 |
3 |
研究型 |
（六）本课程与其它课程的联系
学习本课程之前，应先掌握关于生物化学、微生物学、分子生物学等，为学生后继课程的学习和今后从事生物科学相关的教学、科研工作打下扎实的基础。
（七）教材与主要参考书
1. 教材
《分子生物学实验》自编。
2. 主要参考书
《分子生物学实验原理与技术》任林柱 , 张英主编，科学出版社，2015。
《现代分子生物学技术及实验技巧》叶棋浓主编，化学工业出版社，2015。
《分子克隆实验指南》（第四版）J.萨姆布鲁克 主编，黄培堂 译，化学工业出版社，2008.
（八）考核方式
本门课程为考查课程，根据学生上实验课的态度和出勤率，实验操作和实验报告写作和考试成绩对学生进行综合考核和评分。考试成绩占40%，实验报告占40%，考勤和平时成绩占20%。
三．教学内容纲要
实验一、植物基因组DNA的制备
实验目的：
过本实验学习植物基因组DNA的提取原理及实验操作。
实验内容：
以新鲜植物叶片为材料，研磨破碎细胞后，采用CTAB法抽提植物基因组DNA。在低盐浓度的溶液中（0.3 mol/L NaCl）时，CTAB-核酸的复合物从溶液中沉淀，通过离心就可将其与蛋白，多糖类物质分开，在经过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质。最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。最终获得植物基因组DNA。
主要仪器设备：
移液器；高速离心机；
实验二、核酸的DNA琼脂糖电泳
实验目的：
过本实验掌握DNA电泳的原理及操作方法。
实验内容：
带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。核酸电泳是进行核酸研究的重要手段，是核酸探针、核酸扩增和序列分析等技术所不可或缺的组成部分。本实验以琼脂糖凝胶为介质，利用不同浓度的琼脂糖可形成分子筛网孔大小不同的凝胶，在外加电场中带电荷的核酸分子可向正极移动，由于分子大小不同，受的阻力不同将不同分子量的核酸片段进行分离。再由溴化乙啶染色后在紫外灯下进行观察分析。
主要仪器设备：
电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统
实验三、大肠杆菌质粒DNA的制备
实验目的：
了解质粒的性质，掌握大肠杆菌质粒DNA的提取原理及实验操作。
实验内容：
质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。
质粒的分离是利用质粒DNA与染色体DNA在变性与复性中的差异来达到的目的。当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，由于染色体DNA与质粒DNA拓朴构型不同,染色体DNA双螺旋结构解开，而共价闭环质粒DNA的氢键虽被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕仍会紧密地结合在一起。当加入中和液后, 溶液pH调恢复中性，在高盐浓度的情况下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状构并与蛋白质-SDS复合物等形成沉淀；不同的是质粒DNA复性迅速而准确，保持可溶状态而留在上清中。这样，通过离心可沉淀大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质。除去沉淀后上清中的质粒可用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。
主要仪器设备：
移液器；高速离心机；
实验四、双链DNA的酶切及检测
实验目的：
学习质粒DNA的酶切原理及相关实验技术；学习凝胶电泳的原理及质粒电泳的注意事项；观察三种形态的质粒电泳形态。
实验内容：
限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。首先选用合适的限制性内切酶对目标质粒DNA进行酶切。而后对酶切产物以未酶切质粒为对照进行电泳分析。 在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，其分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。如环形DNA分子样品，其中有三种构型的分子：共价闭合环状的超螺旋分子（cccDNA）、开环分子(ocDNA)、和线形DNA分子(IDNA)。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNA＞IDNA＞ocDNA。环状质粒DNA存在三种不同的状态，要求学生在实验中进行观察三种状态的质粒DNA的电泳结果。
主要仪器设备：
电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统；移液器
实验五、目的基因的获得
实验目的：
了解目的基因获得的方法；
掌握PCR反应的基本原理与基本操作技术。
实验内容：
多聚酶链式反应(polymerase chainreaction，PCR)是获得目的基因最主要的技术方法之一。其原理类似于DNA的天然复制过程，在待扩增的DNA片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增 2n倍。
1. 变性：加热使模板DNA在高温下(94℃)变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。
2．退火：使溶液温度降至50-60℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，即退火阶段。
3．延伸：溶液反应温度升至72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸(dNTP)，按5，+3，方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。
上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25-30个循环后DNA可扩增106-109倍，达到可以电泳检测及后期应用的要求。
主要仪器设备：
PCR扩增仪；移液器；电泳仪；电泳槽；凝胶成像系统；
实验六、大肠杆菌感受态细胞的制备
实验目的：
掌握用 CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的原理和方法。
实验内容：
常态细胞不能摄入外部溶液中的DNA分子，所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌，首先必须制备感受态大肠杆菌细胞。 本实验选择对数期生长旺盛的大肠杆菌，在低温条件下采用Ca2+处理大肠杆菌的细胞膜，使细胞膜的通透性发生变化，成为能够允许外源DNA载体分子通过的感受态细胞。
主要仪器设备：
高速离心机；摇床；移液器； 超净工作台
实验七、食物中常见致病菌的检测
实验目的：
了解分子生物学实验技术在食品微生物检测中的应用；
掌握PCR检测微生物的方法。
实验内容：
①查阅资料，了解分子生物学在食品微生物检测方面的应用现状及趋势；
②结合实验室实际，设计合理的实验方案，完成市选定的食物中单核细胞增生性李斯特氏菌的检测方案（教师指导下完成）；
③完成食物中单核细胞增生性李斯特氏菌的检测，完成实验提交实验报告。
主要仪器设备：
PCR扩增仪；恒温培养箱；移液器；电泳仪；电泳槽；凝胶成像系统；
实验八、真核生物启动子顺式作用元件的分析
实验目的：
了解真核生物转录因子调节转录的原理；
学习利用网络数据库资源分析启动子的顺式作用元件。
实验内容：
要求学生自己查找目前网络中启动子分析的数据库资源；选择模式生物中自己感兴趣的某一条基因A启动子区，通过网络顺式作用元件数据库的分析，明了基因A的启动子区含有的顺式作用元件类型、数量等信息，推测目标基因的表达调控因素。
主要仪器设备：
网络计算机
大纲撰写人：化文平
大纲审核人：濮智颖
